Plasmide CRISPR d'Activation (h2) Gfi-1: sc-401315-ACT-2

Le gène humain GFI1 code le répresseur transcriptionnel à doigts de zinc Gfi-1, un facteur nucléaire qui se lie à des motifs d’ADN spécifiques et recrute des complexes corépresseurs afin de moduler la chromatine et de limiter les programmes d’expression génique. Gfi-1 est un régulateur clé du destin des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, influençant la différenciation granulocytaire et lymphoïde, l’apoptose et le contrôle du cycle cellulaire via des réseaux transcriptionnels qui s’articulent avec la signalisation Notch, des voies dépendantes des cytokines et des régulateurs épigénétiques tels que les histone désacétylases. Une expression dérégulée de GFI1 ou des mutations ont été associées à une hématopoïèse aberrante et à des dysfonctions immunitaires, et ce gène est fréquemment impliqué dans la leucémogenèse ainsi que dans d’autres reprogrammations transcriptionnelles liées aux cancers. L’édition du gène GFI1 permet d’appuyer des études mécanistiques sur l’engagement de lignée, la régulation des enhancers et des promoteurs, ainsi que l’identification à l’échelle du génome des cibles (par exemple par intégration ChIP-seq/RNA-seq) dans des modèles cellulaires humains pertinents.

Gfi-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GFI1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gfi-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GFI1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GFI1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gfi-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GFI1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gfi-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gfi-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de GFI1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.