GCNT4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412177-ACT

GCNT4 (Glucosaminyl-(N-acetyl)-Transferase 4) kodiert eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glykosyltransferase, die die β1,6-N-Acetylglucosamin-Verzweigung an mucinartigen O-Glykanen katalysiert und damit Struktur und Menge komplexer Glykokonjugate an der Zelloberfläche sowie in sezernierten Muzinen prägt. Durch die Modulation der Glykanverzweigung beeinflusst GCNT4 den Transport von Glykoproteinen, Rezeptor-Ligand-Interaktionen und lektinvermittelte Signalwege, mit nachgelagerten Effekten auf epitheliale Differenzierung, Barrierefunktion und Zell-Zell-Adhäsion. Veränderte O-Glykosylierungsprogramme sind häufig mit Änderungen der Immunerkennung und tumorassoziierten Glykan-Phänotypen verknüpft, wodurch GCNT4 ein relevanter Knotenpunkt für die Untersuchung glykosylierungsabhängiger Umbauprozesse in Krankheitskontexten ist. Forschende untersuchen die Aktivität von GCNT4 häufig in Signal- und Stoffwechselwegen, die die Muzinbiosynthese, die Glykanverzweigung und die Reifung membranständiger Glykoproteine steuern.

GCNT4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCNT4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCNT4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCNT4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCNT4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCNT4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCNT4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCNT4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCNT4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCNT4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.