Plasmide CRISPR d'Activation (h) GAK: sc-404235-ACT

La GAK humaine (cyclin G–associated kinase) est une kinase sérine/thréonine qui coordonne l’endocytose médiée par la clathrine en régulant la dynamique de l’adaptateur AP2 et du manteau de clathrine, influençant ainsi l’internalisation et le trafic des récepteurs. En contrôlant le décapsidage des vésicules et le tri endosomal, la GAK modifie les sorties de signalisation provenant des récepteurs membranaires et contribue au maintien de la protéostasie cellulaire et de l’homéostasie membranaire. Son activité s’entrecroise avec des réseaux régulateurs liés au cycle cellulaire et des voies de réponse au stress qui dépendent d’un transport vésiculaire efficace. Une expression ou une fonction altérée de la GAK a été associée dans la littérature à des phénotypes pertinents pour la neurodégénérescence et l’oncologie, ce qui soutient son utilisation comme nœud mécanistique pour étudier le remodelage des voies dans des contextes pathologiques.

GAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GAK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GAK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GAK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GAK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GAK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GAK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GAK dans les cellules tumorales présentant une expression de GAK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.