G-CSF CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419844-ACT

Das murine Csf3 kodiert den Granulozyten‑Kolonie‑stimulierenden Faktor (G‑CSF), ein sezerniertes Zytokin, das die Granulopoese steuert, indem es Proliferation, Differenzierung und Überleben neutrophiler Vorläuferzellen fördert und reife Granulozyten aus dem Knochenmark mobilisiert. G‑CSF signalisiert hauptsächlich über CSF3R und aktiviert dabei die Signalwege JAK/STAT, MAPK/ERK und PI3K/AKT, wodurch es die Homöostase des angeborenen Immunsystems und Entzündungsreaktionen koordiniert. Eine veränderte Aktivität der Csf3/G‑CSF‑Achse wird häufig in Modellen von Infektionen und steriler Entzündung sowie in Kontexten myeloider Expansion und neutrophilengetriebener Gewebeschädigung untersucht. In der Tumorbiologie und Immunologie wird G‑CSF außerdem eingesetzt, um zu untersuchen, wie zytokingetriebene Myelopoese das myeloide Kompartiment in entzündlichen Mikroumgebungen prägt.

G-CSF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Csf3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G-CSF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Csf3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Csf3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G-CSF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Csf3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G-CSF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G-CSF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Csf3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.