Plásmido CRISPR de Activación (h) FLIP_S/L: sc-400400-ACT

CFLAR codifica la proteína inhibidora celular de FLICE (FLIP), que se expresa en las isoformas FLIP_S y FLIP_L, las cuales modulan la apoptosis y la necroptosis iniciadas por receptores de muerte. Al interactuar con FADD y la procaspasa-8 en el complejo de señalización inductor de muerte, FLIP ajusta la activación de la caspasa-8 y, con ello, influye en las salidas de las vías de TNF, Fas/CD95 y TRAIL, así como en la señalización downstream de NF-κB. Mediante este papel regulador, CFLAR afecta las decisiones de supervivencia celular, la señalización inflamatoria y la homeostasis inmunitaria. La alteración de la expresión de CFLAR/FLIP se ha asociado con una resistencia desregulada a la apoptosis y con patologías relacionadas con el sistema inmunitario, lo que lo convierte en un nodo de interés frecuente en estudios sobre la supervivencia de células tumorales, las respuestas a infecciones y la señalización de estrés impulsada por citocinas.

FLIPS/L El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CFLAR sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FLIPS/L El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CFLAR en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CFLAR, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FLIPS/L. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CFLAR y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FLIPS/L en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FLIPS/L en células tumorales con expresión de CFLAR silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.