FKRP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404396-ACT

FKRP codifica a proteína relacionada à fukutina, uma glicosiltransferase residente no Golgi necessária para a modificação pós-traducional da α-distroglicana, um receptor-chave que conecta a matriz extracelular ao complexo distrofina–glicoproteína. Por seu papel na glicosilação O-manosídica, FKRP sustenta a integridade da membrana basal e a estabilidade do sarcolema, influenciando a manutenção das fibras musculares e a organização do tecido neuromuscular. A interrupção da glicosilação dependente de FKRP compromete a ligação de ligantes à α-distroglicana e está fortemente associada a fenótipos de distroglicanopatia, incluindo distrofia muscular de cinturas e subtipos de distrofia muscular congênita. Como um nó de via que conecta a maquinaria de glicosilação à sinalização da matriz extracelular, FKRP é amplamente estudada em modelos de patologia muscular e de comportamento celular dependente da matriz.

FKRP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FKRP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FKRP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FKRP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FKRP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FKRP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FKRP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FKRP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FKRP em células tumorais com expressão de FKRP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.