Fibronectin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420394-ACT

Fn1 kodiert für Fibronectin, ein hochmolekulares extrazelluläres Matrixglykoprotein, das durch Bindung an Integrine und zahlreiche Matrixkomponenten Zelladhäsion, Migration und die Organisation des Zytoskeletts steuert. Die Fibronectin-Signalübertragung ist mit der Dynamik fokaler Adhäsionen, dem Aktin-Remodeling und der Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren verknüpft und beeinflusst Prozesse wie Wundheilung, Angiogenese und epithelial–mesenchymale Transitionen. In Mausmodellen werden veränderte Fn1-Expression oder Matrixassemblierung häufig mit Gewebefibrose, Tumor–Stroma-Interaktionen und inflammatorischem Remodeling in Verbindung gebracht, was Fn1 zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung der Regulation der extrazellulären Matrix in krankheitsrelevanten Mikroumgebungen macht.

Fibronectin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Fn1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fibronectin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Fn1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Fn1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fibronectin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Fn1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fibronectin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fibronectin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Fn1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.