Plasmide CRISPR d'Activation (m) Fibronectin: sc-420394-ACT

Fn1 code la fibronectine, une glycoprotéine de la matrice extracellulaire de haut poids moléculaire qui coordonne l’adhésion et la migration cellulaires ainsi que l’organisation du cytosquelette via sa liaison aux intégrines et à de multiples composants de la matrice. La signalisation de la fibronectine s’articule avec la dynamique des adhésions focales, le remodelage de l’actine et la disponibilité des facteurs de croissance, influençant des processus tels que la réparation des plaies, l’angiogenèse et les transitions épithélio-mésenchymateuses. Dans des modèles murins, une expression modifiée de Fn1 ou un assemblage altéré de la matrice est fréquemment associé à la fibrose tissulaire, aux interactions tumeur–stroma et au remodelage inflammatoire, ce qui en fait un nœud clé pour étudier la régulation de la matrice extracellulaire dans des microenvironnements pertinents pour la maladie.

Fibronectin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Fn1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Fibronectin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Fn1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Fn1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Fibronectin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Fn1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Fibronectin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Fibronectin dans les cellules tumorales présentant une expression de Fn1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.