Fibrillarin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400741-ACT

FBL codifica a fibrilarina, uma metiltransferase nucleolar essencial que catalisa a metilação 2′-O da ribose do pré-rRNA em complexos snoRNP da caixa C/D, sustentando o processamento correto do rRNA e a biogênese de ribossomos. Por seus papéis na organização do nucléolo e na coordenação da modificação de RNA com a capacidade transcricional e traducional, a fibrilarina contribui para programas fundamentais de proteostase e crescimento celular. A atividade nucleolar alterada e a produção desregulada de ribossomos — processos dos quais o FBL é um componente central — são frequentemente associadas a respostas ao estresse oncogênico e a outras doenças caracterizadas por metabolismo de RNA comprometido. Como um hub conservado em vias de processamento de RNA, o FBL é amplamente usado como marcador e como ponto de entrada mecanístico para estudar a função nucleolar e a montagem de ribonucleoproteínas.

Fibrillarin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FBL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Fibrillarin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FBL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FBL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Fibrillarin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FBL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Fibrillarin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Fibrillarin em células tumorais com expressão de FBL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.