FBXW5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404410-ACT

FBXW5 kodiert einen F‑Box‑ und WD‑Repeat‑haltigen Substratrezeptor innerhalb von SCF‑(SKP1–CUL1–F‑Box‑)E3‑Ubiquitinligase‑Komplexen, die die Zielspezifität für den ubiquitinvermittelten proteasomalen Abbau festlegen. Über den regulierten Umsatz von Signal- und Zellzyklus-assoziierten Proteinen trägt FBXW5 zur Kontrolle der Proteostase, zur Koordination von Checkpoints und zur Modulation von Signalwegen bei, die mit Wachstum und Stressantworten verknüpft sind. Eine veränderte Aktivität des Ubiquitin‑Proteasom‑Systems unter Beteiligung von F‑Box‑Proteinen wird häufig mit dysregulierter Proliferation und genomischer Stabilität in Verbindung gebracht, wodurch FBXW5 einen relevanten Knotenpunkt für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und verwandten zellulären Phänotypen darstellt. Als menschliches Gen wird FBXW5 häufig daraufhin untersucht, wie Substraterkennung und Abbaukinetik die Ausgabe von Signalwegen in spezifischen zellulären Kontexten verändern.

FBXW5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FBXW5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FBXW5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FBXW5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FBXW5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FBXW5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FBXW5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FBXW5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FBXW5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FBXW5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.