Plasmide CRISPR d'Activation (h) FANCB: sc-417439-ACT

FANCB code un composant central de la voie de réparation de l’ADN de l’anémie de Fanconi (FA), qui préserve l’intégrité du génome pendant la phase S en favorisant la réparation des pontages interbrins de l’ADN. Au sein du complexe central FA, FANCB soutient l’assemblage et l’activité du module E3 ubiquitine‑ligase qui monoubiquitine FANCD2 et FANCI, permettant ensuite leur coordination avec les mécanismes de recombinaison homologue et de protection des fourches de réplication. Une perturbation ou un dysfonctionnement de FANCB compromet le réseau FA/BRCA, augmentant le stress réplicatif, l’instabilité chromosomique et la sensibilité aux dommages induits par les agents pontants. Des variants pathogènes de FANCB sont associés à l’anémie de Fanconi ainsi qu’à des phénotypes apparentés de développement anormal et d’insuffisance médullaire, faisant de la régulation de FANCB un levier utile pour étudier les réponses aux dommages de l’ADN.

FANCB Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FANCB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FANCB Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FANCB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FANCB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FANCB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FANCB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FANCB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FANCB dans les cellules tumorales présentant une expression de FANCB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.