ERp72 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402689-ACT

Humanes PDIA4 kodiert ERp72, eine Protein-Disulfid-Isomerase des endoplasmatischen Retikulums (ER), die den Thiol–Disulfid-Austausch katalysiert und damit die oxidative Faltung sowie die Qualitätskontrolle neu synthetisierter sekretorischer und membranständiger Proteine unterstützt. ERp72 wirkt innerhalb des Proteostase-Netzwerks des ER zusammen mit Chaperonen und anderen PDIs, trägt zur ER-assoziierten Degradation (ERAD) bei und puffert Störungen ab, die die Unfolded-Protein-Response (UPR) auslösen. Über diese Funktionen beeinflusst PDIA4 die Redox-Homöostase, die antigenpräsentationsbezogene Prozessierung und die Sekretionskapazität in stark sekretorischen oder gestressten Zellen. Eine dysregulierte ER-Proteostase und PDI-Aktivität werden häufig mit inflammatorischer Signalgebung, metabolischem Stress und der Anpassung von Tumorzellen in Verbindung gebracht, wodurch PDIA4 einen nützlichen Ansatzpunkt zur Untersuchung der Stressantwort-Biologie darstellt.

ERp72 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDIA4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ERp72 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDIA4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDIA4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ERp72-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDIA4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ERp72-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ERp72-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDIA4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.