ERK 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403457-ACT

MAPK6 kodiert die extrazellulär signalregulierte Kinase 3 (ERK3), eine atypische MAP-Kinase, die mitogene und stressbezogene Signale integriert, um Zellwachstum, Differenzierung, Migration und die Zytoskelettdynamik zu regulieren. Die ERK3-Signalübertragung ist mit der nachgeschalteten Regulation von Transkriptionsprogrammen und Kinase-Netzwerken verknüpft, die den Zellzyklusverlauf und die Motilität beeinflussen; in bestimmten Kontexten wurde zudem eine funktionelle Kopplung mit Kinasen wie MK5 beschrieben. Eine fehlregulierte Expression oder Aktivität von MAPK6/ERK3 wurde in mehreren Modellsystemen mit veränderten proliferativen und invasiven Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für die Krebsbiologie und andere Erkrankungen mit aberranter Signalübertragung und Gewebeumbau unterstreicht. Als nicht-kanonische MAPK bietet ERK3 einen ergänzenden Ansatzpunkt, um die Vielfalt der MAPK-Signalwege über die klassische ERK1/2-Kaskade hinaus zu untersuchen.

ERK 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAPK6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ERK 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAPK6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAPK6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ERK 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAPK6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ERK 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ERK 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAPK6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.