Plasmide CRISPR d'Activation (h) ERdj4: sc-410882-ACT

L’ADNJB9 humain code ERdj4, une co-chaperonne Hsp40/DnaJ luminale du réticulum endoplasmique (RE) qui soutient le contrôle qualité du repliement des protéines en stimulant l’activité ATPase de BiP/GRP78. ERdj4 est induite lors du stress du RE et contribue aux programmes de la réponse aux protéines mal repliées (UPR), en couplant le repliement assisté par des chaperonnes à la dégradation associée au RE (ERAD) afin de limiter la protéotoxicité. Par ces fonctions, DNAJB9 aide à réguler la protéostasie, l’homéostasie de la voie de sécrétion et les réseaux transcriptionnels d’adaptation au stress. Dans des contextes de recherche, une protéostasie du RE et une signalisation UPR dérégulées impliquant ERdj4 ont été associées à l’inflammation, à des dysfonctionnements métaboliques et à des phénotypes de mauvais repliement protéique pertinents pour la neurodégénérescence et la biologie des cancers.

ERdj4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DNAJB9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ERdj4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DNAJB9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DNAJB9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ERdj4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DNAJB9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ERdj4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ERdj4 dans les cellules tumorales présentant une expression de DNAJB9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.