Plasmide CRISPR d'Activation (h) Eps8L3: sc-413175-ACT

EPS8L3 code pour Eps8L3, un membre de la famille EPS8-like de protéines régulatrices de l’actine, qui relie les signaux entrants au remodelage dynamique du cytosquelette d’actine cortical. Par ses interactions avec des complexes associés à l’actine, Eps8L3 participe au contrôle des ondulations membranaires (membrane ruffling), des changements de forme cellulaire et de la motilité, des processus qui coordonnent les programmes d’adhésion et de migration. Ces fonctions cytosquelettiques relient EPS8L3 à des voies en aval des récepteurs à activité tyrosine kinase et des GTPases de la famille Rho, qui intègrent les signaux extracellulaires à la formation de protrusions. Une régulation altérée de la dynamique de l’actine et du comportement migratoire est largement pertinente dans les modèles d’invasion et de métastases des cellules cancéreuses, ce qui fait d’EPS8L3 une cible utile pour des études mécanistiques des phénotypes dépendants du cytosquelette.

Eps8L3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EPS8L3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Eps8L3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EPS8L3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EPS8L3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Eps8L3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EPS8L3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Eps8L3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Eps8L3 dans les cellules tumorales présentant une expression de EPS8L3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.