Plásmido CRISPR de Activación (m) EphB6: sc-420202-ACT

El gen Ephb6 de ratón codifica EphB6, un miembro con actividad quinasa deteriorada de la familia de receptores tirosina quinasa Eph que modula la señalización célula–célula mediada por efrinas. EphB6 participa en vías que controlan la adhesión dependiente de contacto, la remodelación del citoesqueleto y la migración celular direccional, y puede influir en la señalización aguas abajo de las GTPasas de la familia Rho y de MAPK mediante el agrupamiento de receptores y las interacciones con correceptores. En tejidos en desarrollo y adultos, EphB6 contribuye a la formación de límites tisulares y a la comunicación entre células inmunitarias, procesos a menudo implicados en alteraciones de la organización tisular y en respuestas inflamatorias desreguladas. Los cambios en la señalización Eph/efrina se asocian de forma amplia con motilidad aberrante e interacciones anómalas con el microambiente, lo que hace que la regulación de EphB6 sea relevante para estudios mecanísticos en modelos de desarrollo, neurobiología y biología del cáncer.

EphB6 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ephb6 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

EphB6 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ephb6 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ephb6, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de EphB6. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ephb6 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de EphB6 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía EphB6 en células tumorales con expresión de Ephb6 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.