Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ep-CAM: sc-400220-ACT

EPCAM code pour la molécule d’adhérence cellulaire épithéliale (Ep-CAM), une glycoprotéine transmembranaire qui médie l’adhésion homophile cellule–cellule et contribue à l’organisation de l’intégrité épithéliale, de la polarité et de la signalisation au niveau des jonctions. Au-delà de l’adhésion, Ep-CAM participe à une protéolyse intramembranaire régulée et à des programmes transcriptionnels en aval qui recoupent des voies de prolifération et de différenciation, notamment via un dialogue avec des réseaux associés à Wnt/β-caténine. Des modifications de l’expression ou de la localisation d’EPCAM sont fréquemment étudiées en biologie des tumeurs épithéliales, dans des phénotypes associés aux métastases et dans des modèles de transition épithélio-mésenchymateuse, et des variants entraînant une perte de fonction d’EPCAM sont liés à des troubles intestinaux congénitaux tels que l’entéropathie à touffes. En tant qu’antigène de surface et marqueur de lignée, Ep-CAM est aussi largement utilisé pour définir des sous-populations épithéliales et pour explorer les transitions d’état cellulaire dans des systèmes pertinents pour le développement et la maladie.

Ep-CAM Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EPCAM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ep-CAM Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EPCAM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EPCAM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ep-CAM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EPCAM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ep-CAM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ep-CAM dans les cellules tumorales présentant une expression de EPCAM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.