ENX-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403611-ACT

Das humane EZH1-Gen kodiert das Polycomb-Gruppenprotein ENX-2, eine katalytische Untereinheit von PRC2, die die repressive Histonmarkierung H3K27me3 setzt, um die Chromatinkondensation und langfristige Genstilllegung zu regulieren. ENX-2 trägt zur Kontrolle abstammungslinien-spezifischer Transkriptionsprogramme während Entwicklung und Differenzierung bei und verknüpft epigenetische Regulation mit Zellzykluskontrolle und der Aufrechterhaltung der zellulären Identität. Als Bestandteil von PRC2 wirkt EZH1 zusammen mit Kernpartnern wie EED und SUZ12, um die transkriptionelle Repression an Polycomb-Zielloci zu koordinieren. Eine fehlregulierte PRC2-Aktivität und veränderte H3K27-Methylierungslandschaften werden häufig in der Krebsbiologie, bei Zustandsübergängen von Stammzellen und in der neurodevelopmentalen Genregulation untersucht, wodurch EZH1 ein relevanter Knotenpunkt für die Erforschung epigenetischer Mechanismen ist.

ENX-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EZH1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ENX-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EZH1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EZH1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ENX-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EZH1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ENX-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ENX-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EZH1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.