Enterokinase HC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403764-ACT

TMPRSS15 kodiert Enteropeptidase, eine Serinprotease vom Typ II mit Transmembrananker, die am Bürstensaum des proximalen Dünndarms exprimiert wird und dort proteolytische Verdauungskaskaden einleitet, indem sie Trypsinogen zu Trypsin umwandelt. Dieser Aktivierungsschritt verstärkt die nachgeschaltete Verarbeitung mehrerer pankreatischer Zymogene und verbindet TMPRSS15 mit Protease-Signalwegen und der luminalen Proteinverdauung. Eine veränderte Enteropeptidase-Aktivität ist mit einer beeinträchtigten Proteinaufnahme und intestinalen Funktionsstörungen assoziiert, und das Gen wird als Marker für die Differenzierung von Enterozyten und die Reifung des Epithels verwendet. Da die Proteaseaktivierung die Nährstoffverwertung und die Homöostase der Mukosa beeinflusst, ist TMPRSS15 für Studien zur gastrointestinalen Physiologie und zur Biologie der epithelialen Barriere relevant.

Enterokinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMPRSS15-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Enterokinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMPRSS15-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMPRSS15-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Enterokinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMPRSS15-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Enterokinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Enterokinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMPRSS15-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.