Plasmide CRISPR d'Activation (h) Endophilin III: sc-403821-ACT

SH3GL3 code l’endophiline III, une protéine de remodelage membranaire contenant un domaine BAR, qui participe à l’endocytose médiée par la clathrine et au recyclage des vésicules synaptiques en détectant et en générant la courbure membranaire. L’endophiline III coordonne son action avec la dynamine et d’autres adaptateurs endocytiques afin de favoriser le bourgeonnement et le trafic vésiculaires, reliant la dynamique membranaire à l’organisation du cytosquelette et à l’internalisation des récepteurs. L’expression de SH3GL3 est enrichie dans les tissus neuronaux et ce gène est couramment étudié dans des voies impliquées dans la neurotransmission, le renouvellement des vésicules et la signalisation intracellulaire. Des altérations de la régulation de l’endocytose et du cycle des vésicules synaptiques sont fréquemment mises en cause dans des mécanismes de maladies liées à la neurobiologie, faisant de SH3GL3 une cible utile pour des études mécanistiques de la fonction neuronale et des défauts de trafic membranaire.

Endophilin III Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SH3GL3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Endophilin III Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SH3GL3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SH3GL3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Endophilin III. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SH3GL3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Endophilin III au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Endophilin III dans les cellules tumorales présentant une expression de SH3GL3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.