Plasmide CRISPR d'Activation (h) Endophilin I: sc-402069-ACT

SH3GL2 code l’endophiline I, un adaptateur contenant un domaine BAR qui façonne la courbure membranaire et coordonne l’endocytose médiée par la clathrine au niveau des synapses neuronales. L’endophiline I couple la signalisation des phosphoinositides au bourgeonnement et au décapsidage des vésicules via des interactions avec la dynamine et la synaptojanine, soutenant le recyclage des vésicules synaptiques et l’internalisation des récepteurs. Par ces fonctions dans le trafic endocytaire et le remodelage du cytosquelette, SH3GL2 contribue à réguler la neurotransmission et l’homéostasie neuronale. Une expression ou une fonction altérée de SH3GL2 a été associée à des contextes de maladies neurodégénératives et neuropsychiatriques, ce qui en fait une cible pertinente pour élucider les mécanismes du dysfonctionnement synaptique.

Endophilin I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SH3GL2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Endophilin I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SH3GL2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SH3GL2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Endophilin I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SH3GL2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Endophilin I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Endophilin I dans les cellules tumorales présentant une expression de SH3GL2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.