Enamelin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403738-ACT

ENAM kodiert Enamelin, ein sekretiertes extrazelluläres Matrix-Glykoprotein, das während der Zahnentwicklung von Ameloblasten stark exprimiert wird und in die entstehende Schmelzmatrix eingebaut wird. Enamelin ist an der Schmelz-Biomineralisation beteiligt, indem es die Nukleation und das Wachstum von Hydroxylapatitkristallen reguliert und während der Matrixreifung mit anderen Schmelzmatrixproteinen und Schmelzproteasen koordiniert zusammenwirkt. Diese Prozesse überschneiden sich mit Signalwegen der Organisation der extrazellulären Matrix und des Mineralstoffwechsels, die Schmelzdicke, Härte und Prismarchitektur steuern. Genetische Veränderungen von ENAM sind eng mit erblichen Störungen der Schmelzbildung verbunden, einschließlich Formen der Amelogenesis imperfecta, wodurch ENAM ein nützliches Modell zur Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in der Biologie mineralisierter Gewebe darstellt.

Enamelin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ENAM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Enamelin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ENAM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ENAM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Enamelin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ENAM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Enamelin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Enamelin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ENAM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.