eIF3α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404354-ACT

EIF3J kodiert eine Untereinheit des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor‑3‑(eIF3-)Komplexes, einem zentralen Regulator der cap-abhängigen Translationsinitiation, der die Rekrutierung der 40S‑ribosomalen Untereinheit und die Auswahl des Startcodons koordiniert. Über seine Rolle bei der Assemblierung von Initiationskomplexen und der Modulation der mRNA-spezifischen Translation beeinflusst EIF3J die Proteostase, das Zellwachstum und die stressadaptive Kontrolle der Translation. Eine Fehlregulation von eIF3‑Untereinheiten wurde mit veränderten Translationsprogrammen in Verbindung gebracht, die onkogene Signalwege, Zellzyklusprogression und Überlebenspfade unterstützen, wodurch EIF3J einen geeigneten Ansatzpunkt darstellt, um translationszentrierte Mechanismen in krankheitsrelevanten Kontexten zu untersuchen. Die Untersuchung der EIF3J‑Funktion kann Aufschluss darüber geben, wie selektive Translation Proliferation, Apoptose sowie Reaktionen auf Nährstoffmangel und ER‑Stress beeinflusst.

eIF3α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF3J-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF3α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF3J-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF3J-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF3α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF3J-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF3α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF3α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF3J-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.