Plásmido CRISPR de Activación (h) eIF2α: sc-400199-ACT

EIF2S1 codifica la subunidad alfa del factor eucariota de iniciación de la traducción 2 humano (eIF2α), un regulador central del inicio de la traducción de ARNm y de la proteostasis. La fosforilación de eIF2α en Ser51 integra señales de la respuesta integrada al estrés (ISR) a través de quinasas que incluyen PERK, GCN2, PKR y HRI, lo que reduce la síntesis global de proteínas mientras favorece programas de traducción selectiva como ATF4. Mediante este mecanismo, EIF2S1 conecta el estrés del RE, la privación de nutrientes, la detección de virus y el estrés oxidativo con una remodelación transcripcional y metabólica adaptativa. La desregulación de la señalización de eIF2α se ha implicado en diversos contextos, como la neurodegeneración, la tolerancia al estrés de las células cancerosas y la fisiopatología inflamatoria, lo que hace que la modulación de EIF2S1 sea útil para diseccionar esta vía.

eIF2α El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EIF2S1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

eIF2α El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EIF2S1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EIF2S1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de eIF2α. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EIF2S1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de eIF2α en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía eIF2α en células tumorales con expresión de EIF2S1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.