eIF1B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403809-ACT

EIF1B kodiert den humanen eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 1B (eIF1B), eine konservierte Komponente der Initiationsmaschinerie der Translation, die die Auswahl des Startcodons und die effiziente Assemblierung von Initiationskomplexen unterstützt. Indem eIF1B die globale Kapazität der Proteinsynthese beeinflusst, ist es mit zellulären Programmen verknüpft, die auf eine präzise Kontrolle der Translation angewiesen sind, darunter Zellzyklusprogression, Stressantworten sowie die Anpassung an Nährstoff- und Wachstumsfaktorsignale. Eine dysregulierte Translationsinitiation ist ein wiederkehrendes Merkmal proliferativer und stressadaptiver Zustände, wodurch EIF1B für mechanistische Studien der Genexpressionsregulation in krankheitsassoziierten Kontexten relevant ist. Eine Störung von EIF1B kann daher genutzt werden, um zu untersuchen, wie eine veränderte Initiationsgenauigkeit und Translationsleistung nachgeschaltete Signalwege und Phänotypen umformen.

eIF1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF1B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF1B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF1B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.