Plasmide CRISPR d'Activation (h) DTX3L: sc-403953-ACT

DTX3L (deltex E3 ubiquitin ligase 3L) code une ligase E3 de l’ubiquitine humaine qui participe à la régulation des protéines dépendante de l’ubiquitine et coopère avec PARP9 dans la signalisation stimulée par l’interféron. En modulant l’ubiquitination et via une communication croisée avec la machinerie de la réponse aux dommages de l’ADN, DTX3L contribue au contrôle du renouvellement des protéines, de processus associés à la chromatine et des effets des voies de l’immunité innée. Une activité altérée de DTX3L a été associée à une signalisation inflammatoire dérégulée et à des modifications des réponses cellulaires au stress, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la régulation immunitaire et de la stabilité du génome. Ses fonctions moléculaires font de DTX3L un nœud utile pour disséquer la dynamique des voies de l’ubiquitine et les programmes transcriptionnels induits par l’interféron.

DTX3L Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DTX3L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DTX3L Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DTX3L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DTX3L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DTX3L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DTX3L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DTX3L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DTX3L dans les cellules tumorales présentant une expression de DTX3L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.