Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dpl: sc-403482-ACT

PRND code la protéine humaine Doppel (Dpl), une glycoprotéine de surface cellulaire ancrée par glycosylphosphatidylinositol (GPI), structurellement apparentée à la protéine prion et enrichie dans les tissus reproducteurs. Dpl participe à des processus liés aux microdomaines membranaires, au contrôle qualité des protéines et aux réponses au stress cellulaire, avec des liens rapportés avec l’équilibre rédox et la signalisation apoptotique selon le contexte cellulaire. L’altération de l’expression de PRND a été étudiée en lien avec la biologie des prions dans les maladies neurodégénératives et avec des phénotypes associés aux tumeurs, ce qui étaye son utilisation comme marqueur pour l’exploration de voies plutôt que comme facteur causal direct. La modulation des niveaux de Dpl permet des études mécanistiques de la survie cellulaire, des états de différenciation et des réseaux protéiques liés aux prions dans des modèles humains pertinents.

Dpl Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRND sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dpl Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRND dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRND, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dpl. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRND natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dpl au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dpl dans les cellules tumorales présentant une expression de PRND silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.