DNA pol ζ CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422655-ACT

Rev3l kodiert die katalytische Untereinheit der DNA-Polymerase ζ (pol ζ), einer spezialisierten Polymerase der B-Familie, die für die Translesions-DNA-Synthese und die Toleranz gegenüber replikationsblockierenden Läsionen essenziell ist. In Mauszellen wirkt pol ζ im Rahmen der DNA-Schadensantwort mit REV1 und ubiquitinmodifiziertem PCNA zusammen, um von fehlgepaarten oder beschädigten Primerenden aus weiter zu synthetisieren und so unter genotoxischem Stress das Voranschreiten der Replikationsgabel zu fördern. Diese Aktivität beeinflusst die Mutageneseraten und die Genomstabilität und verknüpft Rev3l-regulierte Signalwege mit Mechanismen, die die Mutationsakkumulation während der Karzinogenese prägen, sowie mit der zellulären Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Substanzen. Da die Funktion von Rev3l Schnittstellen zu Signalen bei Replikationsstress und zur Wahl des Reparaturwegs aufweist, wird es häufig in Modellen der genomischen Instabilität, der Immundiversifizierung und der Entwicklungsviabilität untersucht.

DNA pol ζ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Rev3l-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol ζ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Rev3l-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Rev3l-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol ζ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Rev3l-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol ζ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol ζ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Rev3l-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.