Plásmido CRISPR de Activación (m) DNA pol γ: sc-422341-ACT

Polg codifica la ADN polimerasa gamma, la polimerasa catalítica responsable de la replicación y reparación del ADN mitocondrial en células de ratón. La ADN pol γ funciona con subunidades accesorias para sostener el mantenimiento del mtDNA, vinculando la capacidad de fosforilación oxidativa con la biogénesis mitocondrial, la estabilidad del nucleoide y las respuestas al estrés del orgánulo. La alteración o disrupción de la actividad en el eje POLG se asocia con el agotamiento del mtDNA o con la acumulación de deleciones, lo que puede modelar fenotipos de disfunción mitocondrial relevantes para mecanismos de enfermedad neuromuscular y metabólica. Por ello, Polg se utiliza ampliamente para investigar la integridad del genoma mitocondrial, la dinámica de la horquilla de replicación y las vías de señalización retrógrada que acoplan defectos mitocondriales con programas transcripcionales nucleares.

DNA pol γ El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Polg sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DNA pol γ El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Polg en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Polg, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DNA pol γ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Polg y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DNA pol γ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DNA pol γ en células tumorales con expresión de Polg silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.