Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNA pol α: sc-402762-ACT

POLA1 code la sous-unité catalytique de la polymérase ADN alpha humaine (ADN pol α), une polymérase associée à la primase, essentielle à l’initiation de la réplication de l’ADN chromosomique en allongeant les amorces ARN–ADN synthétisées aux origines de réplication et sur le brin retardé. Cette activité place POLA1 au cœur du programme d’initiation de la réplication, en coordination avec l’octroi de licence des origines et l’assemblage du replisome, afin de soutenir la progression de la phase S et la stabilité du génome. Une perturbation de la fonction de l’ADN pol α peut favoriser le stress réplicatif, modifier la dynamique des fourches de réplication et déclencher en aval des réponses aux dommages de l’ADN qui recoupent la signalisation des checkpoints et les voies de maintenance de la chromatine. POLA1 a été impliqué dans des troubles liés à une altération du métabolisme des acides nucléiques et de la signalisation immunitaire, et il est fréquemment étudié dans le contexte du contrôle de la prolifération et de l’instabilité génomique associée à la réplication.

DNA pol α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol α dans les cellules tumorales présentant une expression de POLA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.