Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dia 1: sc-401929-ACT

DIAPH1 (Dia 1) code une formine apparentée à Diaphanous qui régule la nucléation et l’élongation des filaments d’actine en aval de la signalisation des GTPases Rho. Dia 1 coordonne le remodelage du cytosquelette nécessaire à la polarité cellulaire, à l’adhésion, à la cytocinèse et à la migration dirigée, et contribue également à la stabilisation des microtubules via le dialogue actine–microtubules. Par ces processus, DIAPH1 influence des voies qui gouvernent la mécanotransduction et la dynamique membranaire, notamment la formation de filopodes et l’assemblage de l’anneau contractile. Une activité dérégulée de DIAPH1 a été associée à des phénotypes altérés de motilité et de division cellulaires, et est reliée dans la littérature à des phénotypes développementaux et hématologiques/vasculaires, ce qui soutient sa pertinence pour les études des mécanismes de maladie.

Dia 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DIAPH1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dia 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DIAPH1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DIAPH1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dia 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DIAPH1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dia 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dia 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DIAPH1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.