DGK-κ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410308-ACT

DGKK kodiert die Diacylglycerol-Kinase Kappa (DGK-κ), eine Lipidkinase, die Diacylglycerol phosphoryliert und dadurch Phosphatidsäure erzeugt, womit sie die Dynamik der Second-Messenger-Signalübertragung mitprägt. Durch die Kontrolle des Gleichgewichts zwischen DAG- und PA-abhängigen Effektoren beeinflusst DGK-κ PKC- sowie Ras/MAPK-gekoppelte Signaloutputs, mit nachgelagerten Auswirkungen auf Membrantransport, Zytoskelett-Umbau und Transkriptionsprogramme. Die DGKK-Aktivität wird mit zellulären Prozessen in Verbindung gebracht, die für die Zuverlässigkeit der Signaltransduktion in immunologischen und epithelialen Kontexten relevant sind, und veränderte Signalgebung innerhalb der DGK-Familie wird häufig im Zusammenhang mit entgleister Proliferation und entzündlicher Signalübertragung untersucht. DGKK wird außerdem hinsichtlich seines Beitrags zu krankheitsassoziierten Störungen in Lipid-Signalnetzwerken erforscht, einschließlich Signalwegen, die mit onkogener Signalgebung und Immunregulation verknüpft sind.

DGK-κ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DGKK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DGK-κ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DGKK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DGKK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DGK-κ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DGKK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DGK-κ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DGK-κ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DGKK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.