DBH CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402441-ACT

Dopamin-β-Hydroxylase (DBH) kodiert eine kupferabhängige Monooxygenase, die die Umwandlung von Dopamin zu Noradrenalin katalysiert – ein zentraler Schritt der Katecholaminbiosynthese in sympathischen Neuronen und chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks. Die DBH-Aktivität unterstützt den vesikulären Neurotransmitterstoffwechsel und ist in Tyrosinhydroxylase-gesteuerte Signalwege eingebunden, die die adrenerge Signalübertragung, neuroendokrine Stressantworten und die kardiovaskuläre Homöostase regulieren. Veränderte DBH-Expression oder -Enzymfunktion wurde mit dysregulierten Noradrenalinspiegeln in Verbindung gebracht und wird im Kontext neuropsychiatrischer Merkmale und autonomer Dysfunktionen untersucht. Als molekularer Marker des katecholaminergen Zustands wird DBH häufig verwendet, um die Identität noradrenerger Zelllinien, neuronale Reifung und stimulusabhängige Neurotransmitter-Umprogrammierung zu untersuchen.

DBH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DBH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DBH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DBH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DBH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DBH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DBH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DBH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DBH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DBH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.