DAP12 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400916-ACT

TYROBP kodiert das DNAX-aktivierende Protein 12 (DAP12), einen ITAM-haltigen transmembranen Adapter, der aktivierende Rezeptoren auf myeloiden und lymphoiden Zellen mit nachgeschalteten Signalwegen koppelt. DAP12 bildet Komplexe mit Rezeptoren wie TREM2, SIRPβ1 und bestimmten NK-Zell-Rezeptoren, fördert dadurch die Phosphorylierung von SYK/ZAP70 und aktiviert PI3K-, MAPK- und NF-κB-Signalwege, die Phagozytose, Zytokinproduktion, oxidativen Burst und Zellüberleben regulieren. In Mikroglia und Makrophagen prägt die TYROBP-abhängige Signalübertragung die Aktivierung der angeborenen Immunantwort, den Lipidstoffwechsel und die Beseitigung zellulärer Trümmer, wodurch eine Verbindung zu neuroinflammatorischen Prozessen und Immunfehlregulation entsteht. Eine veränderte TYROBP/DAP12-Signalgebung wurde mit entzündlichen und neurodegenerationsbezogenen Phänotypen in Zusammenhang gebracht und stellt damit ein nützliches Ziel für die Untersuchung von Rezeptor-Adapter-Signalnetzwerken in menschlichen Immunzellen dar.

DAP12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TYROBP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DAP12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TYROBP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TYROBP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DAP12-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TYROBP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DAP12-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DAP12-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TYROBP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.