Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cytokeratin 3: sc-402161-ACT

KRT3 code la cytokératine 3, une protéine de filament intermédiaire de type II qui s’associe à la kératine 12 pour former le réseau cytosquelettique central des cellules épithéliales cornéennes différenciées. La cytokératine 3 contribue à la stabilité mécanique, à la forme cellulaire et à la résistance aux contraintes de cisaillement en s’intégrant à l’assemblage des filaments intermédiaires et en coordonnant ses interactions avec des structures associées aux desmosomes et aux hémidesmosomes. Son expression reflète les programmes de maturation de l’épithélium et est liée à des processus tels que le maintien de la barrière, la réparation des plaies et le remodelage épithélial. Des profils d’expression de kératines dérégulés, notamment des altérations de KRT3, sont utilisés pour étudier les états de différenciation de l’épithélium cornéen et les pathologies de la surface oculaire dans des modèles expérimentaux.

Cytokeratin 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KRT3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cytokeratin 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KRT3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KRT3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cytokeratin 3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KRT3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cytokeratin 3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cytokeratin 3 dans les cellules tumorales présentant une expression de KRT3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.