Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cytokeratin 10: sc-400193-ACT

KRT10 code la cytokératine 10, une protéine de filament intermédiaire de type I qui s’associe à la kératine 1 pour former le réseau kératinique suprabasal dans les kératinocytes épidermiques en cours de différenciation. Cette charpente cytosquelettique confère une résistance mécanique, se connecte à l’adhérence desmosomale et coordonne les programmes de différenciation terminale, notamment la stratification et la formation de l’enveloppe cornée. L’expression de KRT10 est étroitement liée à la maturation des kératinocytes et à un contrôle transcriptionnel spécifique des tissus, et des perturbations de l’homéostasie des filaments de kératine peuvent altérer l’intégrité épithéliale et la signalisation du stress. Des modifications génétiques et d’expression impliquant KRT10 sont associées à des troubles de la différenciation épidermique et à l’hyperkératose, constituant un axe utile pour étudier la biologie de la barrière cutanée et les mécanismes des maladies épithéliales.

Cytokeratin 10 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KRT10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cytokeratin 10 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KRT10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KRT10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cytokeratin 10. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KRT10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cytokeratin 10 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cytokeratin 10 dans les cellules tumorales présentant une expression de KRT10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.