cystatin S CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416501-ACT

CST4 kodiert Cystatin S, ein sezerniertes Cystatin vom Typ 2, das als reversibler Inhibitor papainähnlicher Cysteinproteasen wie Cathepsinen wirkt und damit zur Regulation der extrazellulären Proteolyse sowie proteasegetriebener Signalwege beiträgt. Es wird besonders stark in Speichel und anderen mukosalen Sekreten exprimiert und unterstützt dort die Homöostase epithelialer Oberflächen, indem es den Abbau von Proteinen, Peptiden und Matrixbestandteilen moduliert. Durch die Beeinflussung des Gleichgewichts zwischen Proteasen und ihren endogenen Inhibitoren wirkt Cystatin S auf Prozesse, die mit Entzündung, Barriereintegrität und der mikrobiellen Ökologie an mukosalen Grenzflächen verknüpft sind. Eine dysregulierte Cystatin–Cathepsin-Aktivität wurde u. a. im Zusammenhang mit entzündlichen Erkrankungen der Mundhöhle und Atemwege sowie proteaseassoziiertem Gewebeumbau untersucht, was CST4 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Forschung an proteolytischen Netzwerken macht.

cystatin S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CST4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cystatin S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CST4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CST4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cystatin S-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CST4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cystatin S-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cystatin S-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CST4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.