CYP4X1 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-415272-ACT-2

Das humane CYP4X1-Gen kodiert eine Cytochrom-P450-Monooxygenase der CYP4-Familie, die den oxidativen Stoffwechsel endogener Lipide katalysiert und so zur Hydroxylierung von Fettsäuren sowie zu damit verbundenen, aus Eicosanoiden abgeleiteten Signalprozessen beiträgt. Die Aktivität von CYP4X1 steht mit der Homöostase von Membranlipiden und der redoxabhängigen Regulation zellulärer Antworten in Verbindung und verortet das Enzym in Signalwegen, die den Umsatz von Lipidmediatoren und eine gewebespezifische metabolische Spezialisierung koordinieren. Eine dysregulierte Expression oder eine veränderte, mit CYP4X1 assoziierte Lipidoxidation wurde im Kontext von Neurobiologie und Onkologie untersucht, wobei Verschiebungen in Arachidonsäure-assoziierten Metaboliten entzündungsbezogene Signalwege und Programme der Zellproliferation beeinflussen können. Das Gene Editing von CYP4X1 ermöglicht mechanistische Studien zum P450-vermittelten Lipidstoffwechsel, zur Substratkartierung und Metabolomik sowie zur Validierung von Pathway-Effekten in gentechnisch erzeugten Zellmodellen, die für die Biologie humaner Erkrankungen relevant sind.

CYP4X1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP4X1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP4X1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP4X1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP4X1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP4X1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP4X1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP4X1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP4X1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP4X1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.