CYP3A4 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-416463-ACT-2

Das humane CYP3A4-Gen kodiert eine wichtige Cytochrom-P450-Monooxygenase, die hauptsächlich im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist und den oxidativen Metabolismus einer Vielzahl xenobiotischer und endogener Substrate katalysiert, darunter Steroide und Zwischenprodukte der Gallensäuresynthese. Seine Expression und Aktivität werden über Signalwege nukleärer Rezeptoren wie PXR (NR1I2) und CAR (NR1I3) reguliert, wodurch CYP3A4 mit hepatischen Entgiftungsprogrammen, der Redox-Homöostase und Mechanismen von Arzneimittel–Arzneimittel-Interaktionen verknüpft ist. Interindividuelle Variationen, die durch genetische Polymorphismen und induzierbare Transkription bedingt sind, tragen zu einer veränderten Metabolisierungskapazität bei und wurden in pharmakogenomischen Studien mit einer erhöhten Anfälligkeit für unerwünschte Arzneimittelwirkungen sowie mit leberbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht. Die Geneditierung von CYP3A4 ermöglicht die Erstellung isogener Zellmodelle, um Enzymfunktion, regulatorische Elemente und Reaktionen metabolischer Netzwerke zu untersuchen und die Auswirkungen auf die Xenobiotika-Clearance und den Steroidstoffwechsel in humanrelevanten Systemen zu quantifizieren.

CYP3A4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP3A4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP3A4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP3A4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP3A4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP3A4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP3A4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP3A4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP3A4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP3A4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.