CYP27A1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402836-ACT

CYP27A1 kodiert die Sterol-27-Hydroxylase, ein mitochondriales Cytochrom-P450-Enzym, das oxidative Schritte in der Gallensäurebiosynthese aus Cholesterin katalysiert und zum Stoffwechsel von Sterolen und Oxysterolen beiträgt. Durch die Bildung von Zwischenprodukten wie 27‑Hydroxycholesterin beeinflusst CYP27A1 die Cholesterinhomöostase, den Lipidtransport sowie Signalwege, die mit der Mitochondrienfunktion und der metabolischen Regulation verknüpft sind. Eine Störung der CYP27A1-Aktivität ist mit einer veränderten Gallensäurezusammensetzung und Sterolakkumulation assoziiert und wird mit der erblichen Lipidspeicherkrankheit zerebrotendinöser Xanthomatose (CTX) in Verbindung gebracht. Diese Funktionen machen CYP27A1 zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung der mitochondrialen Steroidoxidation, metabolischer Umprogrammierung und sterolgetriebener transkriptioneller Antworten in menschlichen Zellen.

CYP27A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP27A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP27A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP27A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP27A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP27A1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP27A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP27A1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP27A1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP27A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.