Plasmide CRISPR d'Activation (h) cyclin T1: sc-400623-ACT

CCNT1 code la cycline T1, partenaire régulateur de CDK9 au sein du complexe facteur positif d’élongation transcriptionnelle b (P-TEFb), qui stimule la levée de la pause de l’ARN polymérase II en phosphorylant le CTD ainsi que des facteurs d’élongation négatifs. En contrôlant l’élongation transcriptionnelle, la cycline T1 influence la progression du cycle cellulaire, les réponses aux dommages de l’ADN et les programmes de différenciation, et constitue un facteur clé de l’hôte détourné par Tat du VIH-1 pour renforcer la transcription virale. Une activité altérée de P-TEFb et la disponibilité de la cycline T1 ont été associées à des réseaux transcriptionnels dérégulés observés en oncologie et dans des contextes de signalisation inflammatoire. CCNT1 est donc largement étudié dans les voies impliquées dans le contrôle de la transcription, la régulation associée à la chromatine et l’expression génique en réponse au stress.

cyclin T1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCNT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cyclin T1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCNT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCNT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cyclin T1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCNT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cyclin T1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cyclin T1 dans les cellules tumorales présentant une expression de CCNT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.