CRTAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405828-ACT

CRTAP (cartilage associated protein) ist eine im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisierte Komponente des Prolyl‑3‑Hydroxylierungskomplexes, die mit P3H1/LEPRE1 und PPIB/Cyclophilin B zusammenwirkt, um neu synthetisierte fibrilläre Kollagene zu modifizieren und als Chaperon zu begleiten. Durch die Regulation der posttranslationalen Kollagenprozessierung unterstützt CRTAP die korrekte Faltung der Tripelhelix, die Sekretion und den Aufbau der extrazellulären Matrix und verbindet damit die Kollagenbiosynthese mit Signalwegen der ER‑Proteostase. Eine Störung oder verminderte Funktion von CRTAP beeinträchtigt die Homöostase des Bindegewebes und wird mit erblichen Skelettdysplasien in Verbindung gebracht, einschließlich rezessiver Formen der Osteogenesis imperfecta. Daher wird CRTAP in der Matrixbiologie, der Differenzierung von Osteoblasten und Chondrozyten sowie bei Mechanismen des ER‑Stresses im Zusammenhang mit fehlerhafter Kollagenreifung intensiv untersucht.

CRTAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRTAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CRTAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRTAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRTAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CRTAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRTAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CRTAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CRTAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRTAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.