Plásmido CRISPR de Activación (h) CRTAP: sc-405828-ACT

CRTAP (proteína asociada al cartílago) es un componente residente del retículo endoplásmico del complejo de 3-hidroxilación de prolina que colabora con P3H1/LEPRE1 y PPIB/ciclofilina B para modificar y actuar como chaperona de los colágenos fibrilares nacientes. Mediante la regulación del procesamiento posraduccional del colágeno, CRTAP favorece el plegamiento correcto de la triple hélice, la secreción y el ensamblaje de la matriz extracelular, lo que la vincula con la biosíntesis de colágeno y las vías de proteostasis del RE. La alteración o reducción de la función de CRTAP perturba la homeostasis del tejido conectivo y se ha implicado en displasias esqueléticas hereditarias, incluidas formas recesivas de osteogénesis imperfecta. Por ello, CRTAP se estudia ampliamente en biología de la matriz, en la diferenciación de osteoblastos y condrocitos, y en los mecanismos de estrés del RE asociados con una maduración anómala del colágeno.

CRTAP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRTAP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CRTAP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRTAP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRTAP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CRTAP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRTAP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CRTAP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CRTAP en células tumorales con expresión de CRTAP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.