Plásmido CRISPR de Activación (h) creatine kinase-B: sc-401868-ACT

El CKB humano codifica la creatina quinasa B, una fosfotransferasa citosólica que cataliza la transferencia reversible de fosfato entre el ATP y la creatina para generar fosfocreatina, lo que sostiene un amortiguamiento rápido del ATP en células con demandas energéticas fluctuantes. Al acoplar los productos de la glucólisis y la fosforilación oxidativa a la regeneración localizada de ATP, la creatina quinasa B contribuye a la bioenergética celular, al transporte iónico y a la dinámica del citoesqueleto, en particular en tejidos neuronales y otros tejidos excitables. Las alteraciones en la expresión de CKB y en la actividad de la creatina quinasa se han asociado con respuestas al estrés metabólico y se han descrito en estudios sobre disfunción neurológica y bioenergética de células tumorales, lo que refleja su utilidad como marcador y como nodo mecanístico en la investigación de la homeostasis energética.

creatine kinase-B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CKB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

creatine kinase-B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CKB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CKB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de creatine kinase-B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CKB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de creatine kinase-B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía creatine kinase-B en células tumorales con expresión de CKB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.