CPSF4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403190-ACT

Humanes CPSF4 (Cleavage- und Polyadenylierungs-Spezifitätsfaktor, Untereinheit 4) ist eine essenzielle Komponente des CPSF-Komplexes, der das Polyadenylierungssignal AAUAAA erkennt und die 3′-Endspaltung sowie die Addition des Poly(A)-Schwanzes an Prä‑mRNAs koordiniert. Durch die Kopplung von Transkriptionsbeendigung und mRNA-Reifung trägt CPSF4 zur Steuerung von Transkriptstabilität, nukleärem Export und Translationseffizienz bei und verknüpft damit die RNA-Prozessierung mit der globalen Kontrolle der Genexpression. Störungen der CPSF4-abhängigen Polyadenylierung können die Nutzung alternativer Poly(A)-Stellen verschieben und das Isoform-Gleichgewicht verändern, mit nachgelagerten Effekten auf Zellzyklusprogramme, Stressantworten und Differenzierung. Fehlregulierte 3′-End-Prozessierung und veränderte Polyadenylierungslandschaften sind wiederkehrende Merkmale von Krebs und anderen proliferativen oder mit dem RNA-Stoffwechsel assoziierten Erkrankungen, wodurch CPSF4 einen nützlichen Angriffspunkt für mechanistische Studien zu durch RNA-Prozessierung getriebenen Phänotypen darstellt.

CPSF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CPSF4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CPSF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CPSF4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CPSF4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CPSF4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CPSF4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CPSF4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CPSF4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CPSF4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.