cPLA₂ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400678-ACT

PLA2G4A kodiert die zytosolische Phospholipase A2 alpha (cPLA2), ein calciumabhängiges, durch Phosphorylierung reguliertes Enzym, das Membranphospholipide selektiv hydrolysiert und dabei Arachidonsäure freisetzt. Diese Reaktion liefert das Substrat für die Eicosanoid-Biosynthese über Cyclooxygenase- und Lipoxygenase-Wege und verknüpft die cPLA2-Aktivität mit der Produktion von Prostaglandinen und Leukotrienen während inflammatorischer Signalübertragung. cPLA2 integriert Signale aus MAPK/ERK- und anderen stressresponsiven Kinasekaskaden, um die Bildung von Lipidmediatoren, Membranumbau und vesikulären Transport zu koordinieren. Eine fehlregulierte PLA2G4A-Signalgebung wurde mit chronischen Entzündungszuständen, vaskulären Pathologien und der Biologie tumorassoziierter Mikroumgebungen in Verbindung gebracht, was sie zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien lipidgetriebener Signalnetzwerke macht.

cPLA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PLA2G4A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cPLA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PLA2G4A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PLA2G4A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cPLA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PLA2G4A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cPLA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cPLA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PLA2G4A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.