Plásmido CRISPR de Activación (h) COL4A3: sc-400903-ACT

COL4A3 codifica la cadena α3 del colágeno tipo IV, un componente estructural central de las membranas basales que contribuye al ensamblaje de la red y a barreras de filtración específicas de cada tejido. En el glomérulo renal, los andamiajes de colágeno IV que contienen COL4A3 sostienen las interacciones entre podocitos y endotelio, regulan la organización de la matriz extracelular e influyen en la adhesión celular y en la señalización de mecanotransducción a través de vías mediadas por integrinas. Las alteraciones en la expresión o la estructura de COL4A3 comprometen la integridad de la membrana basal y se asocian fuertemente con nefropatías hereditarias, incluidos los trastornos del espectro de Alport y patologías relacionadas de la membrana basal glomerular. Dado que la remodelación del colágeno IV configura los microambientes epiteliales y endoteliales, COL4A3 también es relevante para estudios de fibrosis, recambio de la matriz y función de barrera en múltiples órganos.

COL4A3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de COL4A3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

COL4A3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus COL4A3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional COL4A3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de COL4A3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo COL4A3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de COL4A3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía COL4A3 en células tumorales con expresión de COL4A3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.