Plasmide CRISPR d'Activation (h) COL12A1: sc-402361-ACT

COL12A1 code la chaîne alpha 1 du collagène de type XII, un collagène associé aux fibrilles à triples hélices interrompues (FACIT) qui se localise dans la matrice extracellulaire et se lie aux fibrilles contenant du collagène I afin de réguler la fibrillogenèse, l’organisation de la matrice et les propriétés mécaniques des tissus. Il est enrichi dans les tissus conjonctifs et contribue à l’adhésion cellule–matrice, à la mécanotransduction et au remodelage coordonné pendant le développement et la réparation. Des altérations de l’expression ou de la fonction de COL12A1 sont liées à des maladies héréditaires du tissu conjonctif présentant des phénotypes musculosquelettiques, reflétant son rôle dans l’intégrité des tendons/ligaments et des interfaces cartilage–os. En biologie du cancer et dans le remodelage fibrotique, COL12A1 est fréquemment étudié comme composant stromal de la MEC, associé à la rigidité matricielle et à des microenvironnements invasifs.

COL12A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de COL12A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COL12A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus COL12A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription COL12A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COL12A1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus COL12A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COL12A1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COL12A1 dans les cellules tumorales présentant une expression de COL12A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.