CLN5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408473-ACT

CLN5 kodiert ein lösliches lysosomales Glykoprotein, das an der Aufrechterhaltung der Lysosomenhomöostase und am effizienten Abbau von Makromolekülen innerhalb des endo-lysosomalen Systems beteiligt ist. CLN5 wirkt in lysosomalen Transport- und Proteostasewegen mit, die die Autophagie-Lysosomen-Funktion und die zelluläre Clearance beeinflussen – Prozesse, die für die Gesundheit von Neuronen und langlebigen Zelltypen zentral sind. Eine Störung der CLN5-Funktion wird mit der neuronalen Ceroid-Lipofuszinose in Verbindung gebracht, einer neurodegenerativen lysosomalen Speicherkrankheit, die durch die Anreicherung autofluoreszierenden Speichermaterials und eine fortschreitende zelluläre Dysfunktion gekennzeichnet ist. Daher wird CLN5 häufig in Modellen der Lysosomenbiologie, der Neurodegeneration und von Stressantworten untersucht, die mit einer eingeschränkten Abbaukapazität einhergehen.

CLN5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLN5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLN5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLN5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLN5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLN5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLN5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLN5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLN5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLN5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.