Plasmide CRISPR d'Activation (h) citrate synthase: sc-402227-ACT

Le gène humain **CS** code la citrate synthase, enzyme de la matrice mitochondriale qui catalyse la condensation de l’oxaloacétate et de l’acétyl‑CoA pour former du citrate, initiant ainsi le cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs, TCA). En contrôlant l’entrée dans le métabolisme oxydatif, la citrate synthase soutient la production d’ATP, l’anaplérose et l’approvisionnement en citrate pour la biosynthèse des lipides et du cholestérol via le flux de carbone mitochondrie–cytosol. L’activité de CS est étroitement liée à la biogenèse mitochondriale, à l’homéostasie redox et à l’adaptation métabolique en situation de stress nutritionnel. Des altérations de l’expression de CS ou du fonctionnement du cycle TCA mitochondrial sont fréquemment étudiées dans des contextes de dysfonctionnement métabolique et de remodelage bioénergétique associés à la neurodégénérescence, à des phénotypes cardiométaboliques et au métabolisme tumoral.

citrate synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

citrate synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de citrate synthase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de citrate synthase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie citrate synthase dans les cellules tumorales présentant une expression de CS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.