CHPT1 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-412745-ACT-2

Das menschliche CHPT1 (Cholinphosphotransferase 1) kodiert ein mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiertes Enzym, das den letzten Schritt der Phosphatidylcholin-Biosynthese im Kennedy-Weg katalysiert, indem es Phosphocholin von CDP-Cholin auf Diacylglycerol überträgt. Durch die Regulation der zellulären Phosphatidylcholin-Produktion trägt CHPT1 zur Membranbiogenese, zur Dynamik von Lipidtröpfchen und zur Aufrechterhaltung der Zusammensetzung von Organellenmembranen bei, mit nachgeschalteten Effekten auf den sekretorischen Transport sowie auf Stressantworten, die mit der Lipidhomöostase verknüpft sind. Störungen des Phosphatidylcholin-Stoffwechsels werden über veränderte membranständige Signalplattformen und Lipid-Remodelling mit metabolischer Dysfunktion und onkogenen Phänotypen in Verbindung gebracht. CHPT1 ist daher ein nützliches Ziel für Geneditierungsstudien zur Untersuchung des Phospholipidflusses, der ER-Membranbiologie und von Genotyp-Phänotyp-Zusammenhängen in lipidassoziierten Krankheitsmodellen.

CHPT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHPT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CHPT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHPT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHPT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CHPT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHPT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CHPT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CHPT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHPT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.