CHMP4C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404325-ACT

CHMP4C codifica un componente centrale del macchinario ESCRT-III, che rimodella le membrane nelle fasi tardive dello smistamento endosomiale, della formazione dei corpi multivescicolari e dell’abscissione citocinetica. CHMP4C si integra nel checkpoint dell’abscissione per contribuire a coordinare la separazione finale delle cellule con la segregazione dei cromosomi e l’integrità del genoma, collegando la funzione di ESCRT alla progressione mitotica e alla segnalazione associata al danno al DNA. Un’attività deregolata di ESCRT-III può alterare la downregulation dei recettori, il traffico vescicolare e la fedeltà della divisione cellulare, processi spesso studiati nel contesto della tumorigenesi e dell’instabilità cromosomica. Di conseguenza, CHMP4C è comunemente oggetto di studio in vie che regolano la scissione di membrana, il controllo del ciclo cellulare e le risposte allo stress che influenzano i fenotipi proliferativi e di mantenimento del genoma.

CHMP4C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHMP4C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CHMP4C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHMP4C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHMP4C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CHMP4C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHMP4C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CHMP4C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CHMP4C nelle cellule tumorali con espressione di CHMP4C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.